Aktuelle Methoden zur Nukleinsäureextraktion

Aktuelle Methoden zur Nukleinsäureextraktion

TEIL 1

Die Nukleinsäureextraktion (NAE) ist einer der wichtigsten Schritte in der Molekularbiologie und wird routinemäßig in vielen Bereichen der biologischen und medizinischen Wissenschaften eingesetzt, da dieses Verfahren einen Ausgangspunkt in jedem molekulardiagnostischen Kit darstellt [1].Dieses entscheidende Verfahren ist seit über einem Jahrhundert bekannt und hat sich in den letzten Jahrzehnten erheblich weiterentwickelt.Es müssen jedoch noch einige Fortschritte erzielt werden, damit NAE-Protokolle die Laborumgebungen verlassen und in die „reale Welt“ der Point-of-Care-Diagnostik (POC-Dx) übergehen.

Heutzutage ist bekannt, dass intrazelluläre Nukleinsäuren (NAs) grob in genomische (oder chromosomale), Plasmide und verschiedene Arten von RNAs eingeteilt werden können.Obwohl RNAs Uracil besitzen, während DNAs Thymin enthalten, weisen Nukleinsäuren ähnliche grundlegende biochemische Eigenschaften auf, können jedoch recht unterschiedliche dreidimensionale Strukturen aufweisen (Genom, Plasmid, tRNA, mRNA, rRNA usw.).Trotz der strukturellen Unterschiede können die im vorliegenden Text am häufigsten verwendeten Methoden jedoch auf DNA in ihren vielen Organisationsformaten (chromosomal, Plasmid usw.) sowie auf RNA und ihre mehrdimensionalen Formate (mRNA, rRNA, tRNA) angewendet werden , miRNA usw.) mit geringfügigen Modifikationen.

NAE kann grob in vier Schritte unterteilt werden, die je nach Probe und nachgelagerten Anwendungen moduliert werden können: (i) Zellaufschluss;(ii) Entfernung von Membranlipiden, Proteinen und anderen Nukleinsäuren, (iii) Nukleinsäurereinigung/-bindung aus der Masse;und (iv) Nukleinsäurekonzentration.

Der Zellaufschluss oder -zerfall kann durch physikalische und/oder chemische Methoden erreicht werden, deren Hauptziel darin besteht, die Zellwand und/oder Zellmembranen aufzubrechen.Aufschlussmethoden basieren hauptsächlich auf den Eigenschaften der Probe. Zu diesem Zweck wird eine breite Palette von Werkzeugen und Ansätzen entweder einzeln oder in Kombination verwendet, um den Gewebe-/Zellaufschluss zu erreichen.Lytische Enzyme, chaotrope Mittel und verschiedene Arten von Detergenzien sind die Hauptbestandteile der chemischen Lyse, während die mechanische Methode die Zellen durch Mahlen, Scheren, Schlagen von Perlen und Schocken aufbricht.Es ist interessant festzustellen, dass sich eine andere als erfolgreich erweisen könnte, wenn eine Technik keine guten Ergebnisse liefert.Osmotische Schockmethoden haben in bestimmten Fällen zu besseren Ergebnissen geführt als herkömmliche NA-Reinigungsprotokolle wie Phenol-Chloroform-Extraktion und Perlenschlagen.Der Zellaufschluss ist nicht nur wichtig für die DNA-Extraktion, sondern spielt auch eine entscheidende Rolle in der biopharmazeutischen Industrie, da durch diesen Prozess viele rekombinante Proteine ​​und andere wichtige Bestandteile der Zelle gewonnen werden können.Ein weiterer Ansatz zum Zellaufschluss ist die Kombination verschiedener Methoden.Ein gutes Beispiel ist die enzymatische Lyse, bei der viele Protokolle Proteasen verwenden, um die NA von ihrem schützenden Proteingerüst zu befreien.Auch die Inaktivierung zellulärer Nukleasen, die frei in Lösung gelangen, um die neue proteinfreie NA zu schützen, ist von entscheidender Bedeutung.Eine Kombination aus Detergenzien und chaotropen Salzen in einer einzigen Lösung wird verwendet, um Zellwände und/oder Zellmembranen zu solubilisieren und intrazelluläre Nukleasen zu inaktivieren.Beim mechanischen Aufschluss hingegen wird Kraft eingesetzt, um Bestandteile der Zelle herauszulösen.Ein klassisches Beispiel für das Mahlen in den Biowissenschaften ist die Verwendung von Mörser und Pistill, die heutzutage durch die Verwendung von flüssigem Stickstoff optimiert wird (sofern die Probe dies zulässt).Zellwände können auch durch Stoßwellen zerstört werden, die durch schnelle Druckänderungen verursacht werden, die durch Ultraschall oder Kavitation hervorgerufen werden.Andere mechanische Werkzeuge, die für den Zellaufschluss zur Verfügung stehen, sind Scheren, bei denen eine tangentiale Kraft genutzt wird, um ein Loch in die Zelle zu bohren, und das Perlenschlagen, bei dem verschiedene Glas- oder Stahlperlen zum Aufbrechen der zähen Zellwand verwendet werden, wie bereits erwähnt.

NAE-Methoden umfassen die Extraktion sowohl von DNA als auch von RNA, können aber allgemeiner in chemisch gesteuerte oder Festphasenmethoden charakterisiert werden;beide enthalten die oben genannten vier Schritte.In den nächsten Abschnitten werden wir das Funktionsprinzip und/oder die Begründung für die wichtigsten Methoden untersuchen, die heutzutage in den biologischen und medizinischen Wissenschaften verwendet werden.Da die molekulare Diagnostik stark auf Techniken basiert, die mit NAE beginnen, werden wir auch einige der grundlegenden Funktionen der für POC-Dx verfügbaren Geräte diskutieren und schließlich die Herausforderungen und Einschränkungen bei der Anpassung von NAE-Methoden an diagnostische Tests am Behandlungsort erläutern.