Einkaufsführer PCR-Technologie

Die Polymerase-Kettenreaktionstechnologie (PCR) ist ein fester Bestandteil unzähliger Forschungs- und Testlabore in einer Reihe von Bereichen, darunter Biomedizin, klinische Diagnostik, Lebensmittelmikrobiologietests und Kriminalforensik.Diese grundlegende Technologie nutzt thermische Zyklen, um eine Reihe von Reaktionen zu ermöglichen, bei denen eine DNA-Probe schnell und exponentiell repliziert wird, um Millionen oder Milliarden Kopien der Sequenz zu erzeugen.Bei der Anschaffung eines neuen PCR-Systems ist es wichtig, die Endziele Ihrer Anwendung, die Genauigkeit und Effizienz der Thermozyklusausrüstung sowie die Kapazität und Flexibilität des Instruments zu berücksichtigen.Dieser Artikel gibt einen Überblick über die verschiedenen Optionen und Funktionen, die für PCR-Systeme verfügbar sind, um Ihnen bei der Suche nach einem geeigneten System für Ihre Anwendung zu helfen.

1. PCR vs. qPCR vs. dPCR

Während alle PCR-Systeme DNA mithilfe der Polymerase-Kettenreaktion replizieren, verwenden die verschiedenen Systeme unterschiedliche Methoden, um spezifische Ergebnisse zu erzielen.Zu diesen unterschiedlichen Methoden gehören Standard-PCR, quantitative PCR (qPCR) und digitale PCR (dPCR).

Standard-PCR-Maschinen werden typischerweise zur Amplifikation von DNA für weitere nachgelagerte Tests und Verwendung verwendet;In gewissem Sinne wird diese Technologie als Mittel zur Erzeugung eines Endprodukts und nicht als analytische Testmethode selbst eingesetzt.Die amplifizierte DNA kann erst nach Abschluss der PCR-Reaktion und nicht in Echtzeit gemessen werden. Daher wird diese Methode manchmal als Endpunkt-PCR bezeichnet.Das Endprodukt der herkömmlichen PCR-Amplifikation wird üblicherweise für die nachgeschaltete Klonierung und Sequenzierung verwendet und kann auch mithilfe der Gelelektrophorese überprüft werden, um das Vorhandensein von Zielsequenzen und deren relative Menge bei niedriger Auflösung (basierend auf der Bandenintensität) zu bestätigen.

Für eine schnellere und genauere Quantifizierung der Menge der in einer Probe vorhandenen Zielsequenz verwendet die quantitative PCR (qPCR), auch als Echtzeit-PCR bekannt, während des Amplifikationsprozesses fluoreszierende Sonden, um die Menge der vorhandenen DNA nach jedem Thermozyklus zu überwachen.Durch die Beobachtung, wie viele Zyklen erforderlich sind, um einen bestimmten Schwellenwert der Fluoreszenzintensität zu erreichen, kann der Analytiker beim Vergleich der Ergebnisse mit einer Standardkurve die DNA-Menge im Ausgangsmaterial bestimmen.qPCR kann auch das Vorhandensein oder Fehlen einer Zielsequenz schneller bestätigen als die Endpunkt-PCR und wird daher in diagnostischen Anwendungen wie dem Nachweis von SARS-CoV-2 verwendet (unter Verwendung der reversen Transkription, um zunächst virale RNA in cDNA umzuwandeln).

Digitale PCR (dPCR) ist eine weitere quantitative Methode, bei der PCR-Reaktionen in Tausenden separaten Reaktionskammern stattfinden und die absolute Anzahl der DNA-Moleküle in der Originalprobe anhand der Anzahl der Reaktionskammern bestimmt werden kann, die nach Abschluss der Amplifikation ein Fluoreszenzsignal liefern .Anders als bei qPCR werden Fluoreszenzmessungen nicht in Echtzeit durchgeführt und eine Standardkurve ist nicht erforderlich, um die DNA in der Probe zu quantifizieren.Während dPCR normalerweise mit einem begrenzten Durchsatz und höheren Kosten als qPCR einhergeht, ist es bei der Quantifizierung von DNA präziser, empfindlicher und genauer und eignet sich besonders für Anwendungen wie den Nachweis seltener Mutationen und Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs).

Die Entscheidung, ob Sie sich für eine Endpunkt-PCR (qualitativ/semiquantitativ) gegenüber einer quantitativen Methode (qPCR oder dPCR) entscheiden sollten, ist bei der Betrachtung Ihrer Anwendung relativ einfach, die Wahl zwischen qPCR und dPCR kann jedoch differenzierter sein.qPCR bietet einen hohen Durchsatz, ist kostengünstig und für viele Anwendungen ausreichend empfindlich. Wenn jedoch eine absolute Quantifizierung mit niedrigen Nachweisgrenzen im Vordergrund steht, ist dPCR möglicherweise die bessere Wahl.

2. Die Bedeutung der Temperaturkontrolle

Die Fähigkeit von Thermocyclern, die Temperatur von Proben genau und effizient anzupassen und zu kontrollieren, ermöglicht den Erfolg von Amplifikationsreaktionen und sollte bei der Auswahl jedes PCR-Systems im Mittelpunkt stehen.Verschiedene Systeme bieten möglicherweise unterschiedliche Fähigkeiten in Bezug auf Anstiegsraten, Temperaturgleichmäßigkeit und -genauigkeit sowie die Fähigkeit, Temperaturgradienten über Thermoblöcke hinweg zu erreichen, um die Optimierung der PCR-Methode zu unterstützen.

Die Rampenrate bezieht sich auf die Geschwindigkeit der Temperaturänderungen zwischen Temperaturwechselschritten und wird in den Gerätespezifikationen typischerweise in Grad Celsius pro Sekunde (°C/s) ausgedrückt.Hersteller können Informationen zu maximalen und durchschnittlichen Anstiegsraten bereitstellen und zwischen Anstiegsraten (Heizen) und Abstiegsraten (Kühlen) eines Instruments unterscheiden.Im Allgemeinen entsprechen höhere Rampenraten schnelleren Laufzeiten, Käufer sollten sich jedoch davor hüten, sich auf maximale Rampenraten zu konzentrieren, ohne andere Messgrößen im Zusammenhang mit der Gerätegeschwindigkeit zu untersuchen.Ein Instrument erreicht seine höchste Anstiegsrate möglicherweise nur für kurze Zeit, und die durchschnittliche Anstiegsrate spiegelt das Tempo der Temperaturänderungen besser wider.Während die Spezifikationen für die Rampenrate einen allgemeinen Überblick darüber geben können, wie schnell bestimmte Instrumente laufen können, sollten Sie nach Möglichkeit nach Daten zu den tatsächlichen Laufzeiten suchen, die auf einem Instrument demonstriert wurden, um ein realistisches Bild davon zu erhalten, wie hohe Rampenraten zu schnellen Analysen führen.

Temperaturgenauigkeit und -gleichmäßigkeit sind ebenfalls von entscheidender Bedeutung für erfolgreiche Reaktionen, und obwohl alle Thermocycler darauf ausgelegt sind, die für die PCR erforderlichen Temperaturen zu erzeugen, können bestimmte Funktionen ein höheres Maß an Sicherheit bieten, was für Anwendungen, bei denen die Anzahl der Proben begrenzt sein kann und bei denen zuverlässige Ergebnisse erforderlich sind, von entscheidender Bedeutung ist von größter Bedeutung, beispielsweise in der klinischen Diagnostik und Forensik.Eine präzise Temperaturkontrolle ist auch bei der Verwendung des PCR-Geräts für empfindliche Techniken wie die hochauflösende Schmelzanalyse (HRM) von entscheidender Bedeutung.Ein beheizter Deckel kann eine bessere Temperaturgleichmäßigkeit im gesamten PCR-Röhrchen gewährleisten, da die Probe ohne beheizten Deckel verdunsten und an der Oberseite des Röhrchens kondensieren kann, wo die Temperatur kühler ist.Das Design des Thermoblocks wirkt sich auch auf die Temperaturkontrolle aus.Aluminiumblöcke sind die wirtschaftlichste Option, weisen jedoch die geringste Leitfähigkeit auf, was bedeutet, dass sie die Temperaturgleichmäßigkeit langsamer erreichen und niedrigere Anstiegsraten aufweisen als Blöcke mit höherer Leitfähigkeit.Mit Silber und Gold beschichtete Blöcke sind teurer, ermöglichen aber eine schnellere Wärmeübertragung und sorgen so für eine gleichmäßige Temperaturverteilung im gesamten Block.

Unterschiedliche DNA-Ziele können unterschiedliche Temperaturen erfordern, um die besten Amplifikationsergebnisse zu erzielen.Beispielsweise benötigen GC-reiche Sequenzen höhere Temperaturen für die Denaturierung.Ideale Annealing-Temperaturen werden auch von einer Reihe von Faktoren beeinflusst – während die Temperaturen für diesen Schritt normalerweise auf der Grundlage der Schmelztemperaturen der Primer, Unterschiede in den Schmelztemperaturen zwischen Primerpaaren und dem Einfluss von Reagenzienkonzentration, pH-Wert und Salzkonzentration ausgewählt werden machen die Optimierung der Reaktionstemperaturbedingungen zu einer komplizierten Aufgabe. PCR-Geräte mit Temperaturgradientenfunktionen sind so konzipiert, dass sie die Optimierung von PCR-Methoden unterstützen, indem sie die Prüfung mehrerer Annealing-Temperaturen in einem einzigen Lauf ermöglichen.Abhängig von den Arten und der Vielfalt der Proben, die Sie mit Ihrem PCR-Gerät analysieren möchten, kann sich die Wahl eines Geräts mit Gradientenfunktion als zusätzliche Kosten lohnen, da Sie bei der Optimierung neuer Protokolle in weniger Läufen viel Zeit und Reagenzien sparen.

3. Thermoblöcke

Wie bereits erwähnt, kann der mit einem PCR-Gerät verwendete Thermoblock einen Unterschied bei der Temperaturkontrolle machen, aber das Design des Blocks – und das Design des Geräts zur Aufnahme verschiedener Blöcke – wirkt sich auch auf den Durchsatz, die Kosten für Verbrauchsmaterialien und die Flexibilität aus.Typische Blöcke werden in einem 96-Well- oder 384-Well-Format geliefert, obwohl auch andere Formate wie 48-Well und 1536-Well verfügbar sind.Eine höhere Anzahl an Wells ermöglicht einen höheren Durchsatz bei geringeren Reaktionsvolumina, was zunächst teurer ist, letztendlich aber den Preis pro Reaktion senkt, da für jedes Well ein geringeres Reagenzvolumen verwendet wird.Wenn Sie berücksichtigen, wie viele Proben Sie verarbeiten und wie oft Sie das Gerät verwenden werden, entscheidet dies darüber, ob ein Thermoblock mit niedrigerer oder höherer Wellanzahl für Ihr Labor am praktischsten und kostengünstigsten ist.

Einige Instrumente verfügen über ein festes Blockformat, während andere die Verwendung austauschbarer Blöcke ermöglichen, was mehr Flexibilität beim Wechsel zwischen 96- und 384-Well-Formaten oder zwischen verschiedenen Blockmaterialien für verschiedene Anwendungen bietet.Einige Thermocycler bieten auch Platz für mehrere Blöcke im selben Gerät, sodass unterschiedliche Protokolle gleichzeitig mit verschiedenen Probensätzen ausgeführt werden können.3 Blöcke mit „universellen“ Abmessungen erhöhen die Flexibilität bei der Verwendung von Röhrchen, Streifen oder PCR-Platten unterschiedlicher Größe zusätzlich wie benötigt.

Aufgrund der Schlüsselrolle dieser Komponente bei der Temperaturkontrolle, Probenhandhabung und dem Durchsatz sollten die Thermoblockoptionen bei der Auswahl eines Thermocyclers sorgfältig geprüft werden.Für Labore mit einem geringen Probenvolumen oder solche, die routinemäßig nur eine Handvoll Tests durchführen, können kostengünstigere Festblockgeräte mit einem standardmäßigen 96-Well-Format ausreichen.Allerdings können modulare, flexible Instrumente für Labore mit einer größeren Anzahl von Protokollen, unterschiedlichen Probenvolumina und mehr Benutzern, die für ihre eigenen Tests auf dasselbe Instrument angewiesen sind, sowie für Labore, die ihre Durchsatzkapazität in Zukunft möglicherweise erweitern möchten, von Vorteil sein.